交错式热不对称 PCR

热不对称 PCR 的发展和应用使的不对称 PCR 方法变得更加简单和实用，而 Yao-Guang Liu 等后来又将其进一步发展产生了 TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）：交错式热不对称 PCRIS。TAIL-PCR 的目的是为了扩增与已知序列相邻的未知序列，相对于实现同样目标的其它方法 TAIL-PCR 具有非常明显的优点。

TAIL-PCR 的基本原理是利用一系列序列特异性的巢式引物和一个短的任意引物引导扩增已知序列的侧翼序列，它是一种半特异性的 PCR 反应，由于两类引物的退火温度不同从而可以通过控制反应过程中的退火温度有效的控制特异性和非特异性产物的扩增。在 TAIL-PCR 中序列特异性的巢式引物较长、退火温度较高，因此在 PCR 反应中退火温度的高低（相对）对它与目的序列的退火没有太大的影响，在高、低两种退火温度下都可以与已知序列发生特异性的退火，而序列短的任意引物则仅可以在退火温度较低时与未知序列（已知序列的侧翼序列）发生退火，通过高低退火温度的交替进行，使目的基因得到有效的扩增。TAIL-PCR 具体过程如图 6-3 所示。

交错式热不对称 PCR 可用于扩增与已知序列相邻的未知序列。

器材：

① PCR 仪；

② 电泳仪等。

试剂：

① 合成的寡核苷酸引物；

② 模板 DNA；

③ 4 种 dNTP；

④ Taq DNA 聚合酶。

1、引物设计 TAIL-PCR 中的引物与常规 PCR 相比有明显区别，它有两种，一种是与已知序列特异性退火的巢式引物，另一种是与未知的侧翼序列发生非特异退火的任意引物。作为热不对称 PCR 的发展，TAIL-PCR 的两种引物的退火温度也要求至少相差 10 °C 以上，其 Tm 值也可以根据公式 Tm = 69.3 + 0.41 [（G+C）mol%] - 650/L（L=引物长度）计算。巢式引物的设计比较简单，可以根据已知序列来确定，其退火温度一般在 60 ℃ 以上，任意引物的退火温度一般要在 40 ℃ 以上，而且要考虑简并性。

2、反应体系同热不对称 PCR。

3、扩增策略 TAIL-PCR 的扩增与常规 PCR 不同，在整个过程中是高低退火温度交错的，其条件可参考表。其中第一轮扩增产物稀释 1000 倍。

4、扩增结束可以用 1%~2% 的琼脂糖凝胶进行常规检测，其产物不用纯化即可以进行序列测定。

1、引物在 TAIL-PCR 中两类引物的退火温度必须相差 10 ℃ 以上。

2、反应温度 在高严紧性的循环中退火温度要尽可能的高（一般比特异性引物的匸高 1~5 ℃）。

3、特异性引物选择理想的特异性引物进行第一轮 TAIL-PCR 是保证有效扩增的关键， 所以在扩增结果不理想时应该尝试用其它几个特异性引物进行第一轮 PCR。

4、为了尽量减少特异性引物的错配，特异性引物应该保持较低浓度（大约 0.15~0.2 μmol/L）。