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PCR技术

ISPCR 扩增的产物的杂交和检测实验基本方案

ISPCR

2024-05-15 PCR技术加入收藏

材料与仪器探针SSC SDS 显影液定影液苏木精 PBS AEC 封阻液 NaCl Tris·Cl 二甲基甲酰胺 BCIP NBT 乙醇培养箱盖玻片载玻

材料与仪器

探针
SSC SDS 显影液定影液苏木精 PBS AEC 封阻液 NaCl Tris·Cl 二甲基甲酰胺 BCIP NBT 乙醇
培养箱盖玻片载玻片干燥剂加湿盒

步骤

1. 配如下杂交混合液

（1）2 μl 200 pmol/l 探针（终浓度4 pmol/l）

（2）50 μl 去离子的甲酰胺（终浓度50%）

（3）10 μl 20×SSC（终浓度2×）

（4）10 μl 100×Denhardt 溶液（终浓度10×）

（5）10 μl 10 mg/ml 经超声处理的鲑精DNA（终浓度1 mg/ml）

（6）1 μl 10%SDS（终浓度1%）

（7）7 μl 水

2. 加10 μl 杂交混合液于载玻片各样品孔中，样品孔中含有经原位PCR扩增的核酸。再于各孔上盖以盖玻片，放95℃加热块上加热5 min。

3. 载玻片放加湿盒中，于48℃温育2~4 h。

如用33P-标记探针：

4a. 移去盖玻片，在2×SSC中洗片5 min。

5a. 将载玻片浸于稀释的Kodak乳胶中。

6a. 晾干，然后在有干燥剂的闭光玻片盒中，放3~10天。

7a. 在暗室中，按下列程序对载玻片显影：

（1）依次浸于Kodak显影液，3 min

（2）水，30 s

（3）Kodak Unifix 定影液，3 min

8a. 在室温下，2%Gills 苏木精染液中，温育2~3 min，对玻片进行复染。

如用通过过氧化物酶检测的生物素或地高辛标记探针：

4b. 移去盖玻片，在PBS中洗片2次，每次浸洗5 min。

5b. 加10 μl 100 μg/ml 的链亲和素-过氧化物酶溶液于载玻片各孔中，轻轻盖上盖玻片，置37℃温育1 h。

6b. 移去盖玻片，在PBS中洗片2次，每次浸冼5 min。

7b. 在暗处，加100 μl AEC工作液于载玻片各孔，37℃温育10 min，然后镜下观察，如颜色不够强，再延长显色10 min。

8b. 以自来水浸冼玻片，然后晾干。

如用通过碱性磷酸酶检测的生物素或地高辛标记探针：

4c. 移去盖玻片，室温下，在2×SSC中冼片2次，每次浸洗15 min。然后加100 μl 封阻液于样品孔中，覆盖各孔表面，平放玻片于加湿盒中，室温下温育15 min。

5c. 对每一待显色孔，用10 μl 40 μg/ml 链亲和素-磷性磷酸酶结合物与90 μl 结合物稀释缓冲液混合。

6c. 用吸水纸接触载玻片边缘、吸去封阻液，每孔中加100 μl 按上步稀释好的结合物溶液，平放玻片于加湿盒中，室温下温育15 min。

7c. 于室温下，100 mmol/l Tris·Cl pH7.5/150 mmol/l NaCl中洗片2次，每次15 min，然后，于室温下，再以碱性磷酸酶底物缓冲液，洗片1次（5 min）。

8c. 在Coplin 广口瓶中预热50 ml 碱性磷酸酶底物缓冲液至加37℃，加200 μl 75 mg/ml NBT和166 μl 的50 mg/ml BCIP充分混合。然后，将玻片放此液中置37℃温育，直至达到所期望的显色程度。（通常需10 min~2 h，可间歇性地从溶液中取出玻片，在10×物镜下观察显色程度，但勿使玻片干涸）然后，将玻片浸于去离子水中终止反应，其间换水数次。

9. 室温下，以0.2% Gills 苏木精（如用于过氧化物酶的显色）或1%核酸固红染液（如用基于碱性磷酸酶的显色）染片5 min，浸玻片于自来水中，换水数次。

10. 室温下，依次将玻片置于50%、70%、90%和100%乙醇中，分别温育1 min 进行脱水，然后晾干。

11. 毎孔加1滴固片介质，压上盖玻片，立刻进行结果观察（小心勿动盖玻片），或放室温过夜，使压片介质干燥。