用 PCR 分析连接反应的底物和产物

ddH2O Vent 缓冲液 Vent DNA 聚合酶 dNTP 引物 质粒 DNA
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备 热循环仪

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

ddH2O

2. 酶和酶缓冲液

10X Vent 缓冲液

Vent DNA 聚合酶

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP，各 20 mmol/L

引物，可以与合成的 DNA 文库克隆位点两侧的载体序列退火

质粒 DNA(见下面第 1 步）

4. 特殊设备

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备，包括溴化乙锭

热循环仪

二、方法

1.混合以下组分。

10~50ng 的质粒 DNA

50pmol 的各引物

5ul 的 10X Vent 缓冲液

dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul

1U 的 Vent DNA 聚合酶

用 ddH20 定容至 50ul

下面的每种质粒载体，应该分别进行反应：

未消化载体

消化载体，但没连接

消化载体，并在无文库 DNA 情况下进行连接

消化载体，并用文库 DNA 进行连接

2.在一个热循环仪中，94°C 将混合物预热 20s。

3.按下面的参数进行 30 轮 PCR 循环。

94°C10s

55°C10s(或用引物的合适退火温度）

72°C15s

将最后一个循环的延伸时间延长至 30s

4.冷却至 4°C

5.取 25ul 的各反应产物，跑 4% 的琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色分析（Sam-brook and Russell 2001)。

三、分析

在图 26-3 所示的例子中，在连接之前进行线性化载体的 PCR 分析，显示载体是完全线性化的，因为没有得到起始载体对应的 PCR 产物（图 26-3, 第 4 泳道）。若不存在文库插入片段，连接载体的 PCR 结果显示发生了一定量的自连（图 26-3, 第 2 泳道），并显示存在一小部分的单切载体。然而，当载体与文库插入片段进行连接后，大部分的 DNA 产物与正确连接的文库 DNA 相对应，而没有与起始载体对应的 PCR 产物（图 26-3, 第 3 泳道）。当载体与插入片段连接后，检测不到起始载体对应的 PCR 产物，但仅用载体连接后能检测到 (比较图 26-3 第 2 泳道和第 3 泳道），可以解释为文库 DNA 连接到了单切的载体上。这一副产物不会形成封闭的环状质粒，不能被克隆，也不会产生 PCR 产物。



在这个例子中，PCR 作为一种重要的分析工具，能够很可靠地验证限制性酶切反应和连接反应。因此，研究者可以用正确的 DNA 进行文库构建的后续步骤，更可能最终获得高质量的文库。通过转化和扩增细菌，可以获得最终的文库，再用标准的程序对质粒 DNA 进行纯化（Sam brook and Russell 2001)。