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DNA实验

批量层析方法筛选 poly (A)+ RNA

2024-06-01 DNA实验 加入收藏
原理当处理许多 RNA 样品或处理小量的哺乳动物总 RNA 时(<50 μg),可选择用 oligo (dT) —纤维素进行批量层析的方法。这种方法采用级


原理

当处理许多 RNA 样品或处理小量的哺乳动物总 RNA 时(<50 μg),可选择用 oligo (dT) —纤维素进行批量层析的方法。这种方法采用级别较好的 oligo (dT) —纤维素,在最佳温度进行结合和洗涤。多年来发表了许多纯化 poly (A)+ RNA 的批量层析方法。

材料与仪器

总 RNA
吸附 洗涤缓冲液 醋酸铵 乙醇 冰预冷的水 NaCl TES
比色杯 微量离心机 Oligo (dT)18-30—纤维素 旋转轮 水浴

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

吸附/洗涤缓冲液(含 0.5 mol/L NaCl 的 TES 缓冲液)

醋酸铵(10 mol/L)

乙醇

冰预冷的水

NaCl(5 mol/L)

TES

2. 核酸和寡核苷酸

总 RNA

3. 专用设备

用于测量 260 nm 吸光值的比色杯

有速度控制的微量离心机

Oligo (dT)18-30—纤维素

旋转轮

55℃ 和 65℃ 的水浴

二、方法

1. 在一系列灭菌微量离心管中,将每份总 RNA ( 上限为 1 mg ) 样品的体积用 TES 调整到 600 μl。封好管口,在 65℃ 加热 10 min,然后迅速在冰上冷却到 0℃ 。每份样品加 75 μl ( 0.1 倍体积)5 mol/L NaCl。

2. 在每管中加 50 mg ( 500 μl) 平衡的 oligo (dT)—纤维素,盖好管盖,室温下在旋转轮上温育 15 min。

3. 用微量离心机在室温下离心,600~800 g ( 约 1500~2500 r/min),2 min。

4. 将上清移到一系列干净的离心管中,置冰上存放。

5. 在含 oligo (dT) 的沉淀中加 1 ml 冰预冷的吸附/洗涤缓冲液。温和旋涡震荡分散沉淀。将盖好盖子的离心管置于旋转轮上,室温下温育 2 min。

6. 室温下,用微量离心机离心,600~800 g ( 约 1500~2500 r/min), 2 min。弃上清。 重复步骤 5 和 6 两次。

7. 在含 oligo(dT) 的沉淀中加 0.4 ml 冰预冷的双蒸灭菌水,温和旋涡震荡以重悬沉淀。立即在微离心机上离心,4℃,2 min。

8. 小心吸去上清。

9. 回收结合的 poly(A)+ RNA:用 400 μl 双蒸灭菌水重悬沉淀,在 55℃ 温育 5 min,然后 4℃ 离心 2 min。

10. 将上清移至一系列干净的离心管中,重复步骤 9 两次,合并所有上清。

11. 在上清中加 0.2 倍体积的 10 mol/L 醋酸铵和 2.5 倍体积的乙醇,在 -20℃ 存放 30 min。

12. 回收沉淀的 poly (A)+ RNA: 4℃ 离心,最大速度,15 min。小心弃上清,用 70% 乙醇洗沉淀,短暂离心,吸去上清,将管盖打开,倒置数分钟,使大部分残留的乙醇挥发。

13. 用小体积灭菌的 DEPC 处理的水溶解 RNA。

14. 估计 RNA 浓度。

15. 保存样品。



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