培养细胞中RNA提取及检测
简介RNA的提取通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，
简介
RNA的提取通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。
原理
RNA提取的基本原理是利用异硫氰酸（guanidineisothiocyanale）是一类有效解偶剂，当细胞被它溶解后，蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸解离。在4 mol／L异硫氰酸胍和β-巯基乙醇存在下，RNA酶失活，可提取完整的总RNA。
材料与仪器
器材：
①15 ml、10 ml、5 ml离心管，5 ml移液管，1 ml可调加样器
②匀浆器，低温高速离心机，普通离心机
③紫外分光光度计
试剂：
①材料培养细胞RNA来源
②预冷的PBS缓冲液
③变性液
④氯仿-异戊醇
⑤2 mol／L乙酸钠（pH4.0）
⑥预冷无水乙醇，预冷75％ 乙醇，DEPC处理水
⑦0.25％ 胰蛋白酶
步骤
提取培养细胞中RNA的基本过程可分为如下几步：
（一）试剂的配制
（1）变性液的配制 异硫氰酸胍，47.3 g；十二烷基肌氨酸钠，0.5 g；2.5 ml 1mol／L柠檬酸钠（pH7.0）；0.7 ml β-巯基乙醇；DEPC处理的双蒸水，定容至100 ml，65 ℃加热并搅拌助溶。
（2）焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）处理水 加0.2 ml焦碳酸二乙酯到待处理的100 ml水中，猛烈振播使DEPC均匀混入水中，37 ℃过夜，高压灭菌（1.034 x 105 Pa, 30 min)。
（3）乙酸钠溶液（2 mol／L，pH4.0）乙酸钠，54.4 g；DEPC处理水，20 ml；用冰醋酸调pH至4.0，加DEPC处理水至200 ml，高压灭菌（1.034 x 105 Pa，20 min）。
（4）氯仿-异戊醇混合液（49：1）氯仿，49 ml；异戊醇，1 ml；混合上述液体，4 ℃保存。
（5）70％ 乙醇的配制 无水乙醇，70 ml；DEPC处理水定容至100 ml；混合后置-20 ℃保存。
（二）RNA提取
（1）收集107个以上的细胞 贴壁培养细胞用0.25％ 胰蛋白酶消化，PBS重悬细胞并转移至10 ml离心管中；悬浮培养细胞可直接转移至离心管。
（2）离心（2000 g x 5 min）。PBS洗涤细胞2次。
（3）加2 ml预冷的变性液，充分摇动，使细胞裂解完全。
（4）加0.2 ml 2 mol／L乙酸钠（pH4.0），翻转混合，转移至5 ml离心管中。
（5）加0.5 ml氯仿［氯仿-异戊醇（49：1）］，翻转混合，猛烈振摇10 s，冰浴15 min。
（6）4 ℃离心（10000 g x 20 min）。
（7）将上层水相移入新15 ml离心管，加2倍体积冷无水乙醇，置-20 ℃保持1 h以上。
（8）4 ℃离心（10000 g x 20 min）。
（9）弃上清液，加2 ml变性液重悬沉淀。
（10）转入新管，加2倍体积冷乙醇置-20 ℃沉淀1 h以上。
（11）4 ℃离心（10000 g x 20 min）。
（12）沉淀用70％ 乙醇洗1次。
（13）空气干燥，沉淀溶解在100 μl DEPC处理水中，-70 ℃贮存。
（三）实验结果及分析
（1）取4 μlRNA样品，100倍稀释后于分光光度计上测定260 nm、280 nm处的吸光度值。
（2）样品RNA浓度（μg／ml）＝A260 x 40（μg／ml）x稀释倍数。A260／A280应在1.9～2.0之间，如小于该值，则可能有蛋白杂质。
注意事项
（1）在提取总RNA时一个非常值得注意的问题是防止RNA酶的混入，一般实验室的玻璃器皿、唾液和汗液都可能是RNA酶的污染源，故在操作时始终应戴一次性手套进行，玻璃器皿应在250 ℃烘烤4 h以上或180 ℃烘烤9 h以上，其他器具如电泳仪，应用3％ H2O2浸泡2 h以上，用0.2％ DEPC处理的高压灭菌的蒸馏水冲洗3次以上，烘干待用。
（2）获得抽提mRNA的成功关键是在一开始即将内源性的RNA酶活性减低到最小和在操作过程中防止器皿、唾液和汗等污染。本法在一开始破碎细胞的同时使核酸酶失活，从而可得到较高的回收率。
（3）总RNA在液相，DNA及蛋白质在液相与异硫氰酸胍相之间。
（4）停止离心机以不用刹车为好。
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