RNA 在脊椎动物的胚胎和器官中的整体标本原位杂交和检测实验（小鼠胚、鸡胚或者器官中RNA杂交的酶学检测）

1) 从杂交过的小鼠胚或鸡胚或器官样本移除杂交溶液并加入800μL预杂交溶液A， 7℃洗 5 min。

2) 不要移除预杂交溶液，向试管中再加入400μL 2×SSC, pH 4.5溶液，70℃洗 5 min,重复加2×SSC2次，并再洗2次。

3) 移去混合液，并在0.1% CHAPS/2×SSC中70℃洗两次，每次洗30 min。

4) 用含有20μg/ml RNA 酶 A 的 0.1% (V/V) CHAPS/2×SSC 溶液 37℃消化1 h。

5) 先用MAB室温下洗样本两次，每次10 min,再在70℃用MAB洗2次，每次 30 min。

6) PBS室温下洗样本两次，每次10 min。

7) PBT室温下洗5 min。

8) 室温下用封闭液封闭样本2〜3 h。

9) 移去封闭液，加入2 ml预吸附处理的连接碱性磷酸酶的抗地高辛抗体Fab片段。4℃下轻摇过夜。

10) 移除溶液并加入0.1%(m/V) BSA/PBT溶液，将样本转移到20 ml的带咬合盖玻璃 小瓶中，用0.1% (m/V) BSA/PBT溶液室温下洗5次，每次45 min并轻轻摇晃。

11) 用PBT溶液洗2次，每次30 min。

12) NTMT缓冲液洗3次，每次10 min。

如果使用Boehringer Mannheim公司的BM紫AP底物溶液则只需洗2次。

13) 将样本完全浸没于3 ml NBT/BCIP显色溶液或者BM紫AP底物溶液中孵育。用锡 箔包住小瓶轻轻摇晃20 min开始显色。

14) 用肉眼或者用解剖镜观察染色情况。当信号达到希望的水平时（20 min〜48 h), 用PBT至少洗6次以停止显色反应。

显色的样本能够在4℃下含有100 mmol/L EDTA的PBT中保存2〜3个月而不影响信号强度。

15) 可选：在4%PFA/PBT中4℃固定样本过夜。用PBT洗样本数次然后在PBT中 4℃存储。

16) 样本放在PBT溶液中在皮氏培养皿拍照。

其他试剂：

20μg/ml RNase A (Boehringer Mannheim)溶于 0.1% CHAPS/2×SSC, 70℃。

马来酸缓冲液（MAB) 70℃和室温 ，PBS，PBT ：0.1% Tween-20/PBS，封闭液

连接碱性碟酸酶的抗地高辛抗体的Fab片段（Boehringer Mannheim),预吸附的 40℃，0.1% (m/V) BSA/PBT，碱性磷酸酶缓冲液 pH 9.5 (NTMT),新鲜配制

2 mmol/L左旋咪唑/NTMT (可选的），NBT/BCIP 底物溶液或者 BM 紫 AP 底物