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RNA实验

苯酚法制备酵母tRNA

2024-06-14 RNA实验 加入收藏
材料与仪器DEAE 纤维素 二乙醇胺 (TEA) 溶液 0.lmol LTEA 缓冲液 0.lmol L 氯化钠含 0.lmoi. LTEA 缓冲液 12mol


材料与仪器

DEAE 纤维素 二乙醇胺 (TEA) 溶液 0.lmol LTEA 缓冲液 0.lmol L 氯化钠含 0.lmoi. LTEA 缓冲液 12mol L 氯化钠含 0.lmol LTEA 缓冲液 lmol L 氯化钠含 0.lmol LTEA 缓冲液 乙醚 水饱和酚 乙醇
皂土 电动搅拌器 离心机 部分收集器 紫外分光光度计

步骤

一 材料与设备

1)DEAE 纤维素:称取 20 g 交换量 l.Ommol/gDEAE 纤维素,先用 300 ml0.5mol/L 氢氧化钠浸泡 1〜2 h 搅拌, 倾去上清液后水洗至中性。

2) 二乙醇胺 (TEA) 溶液:先用浓 HC1 调至 pH7.4, 然后稀释成 lmol/L 作为储液。

3)0.lmol/LTEA 缓冲液 (pH7.4)

4)0.lmol/L 氯化钠含 0.lmoi./LTEA 缓冲液,pH7.4,

5)12mol/L 氯化钠含 0.lmol/LTEA 缓冲液,pH7.4。

6)lmol/L 氯化钠含 0.lmol/LTEA 缓冲液,pH7.4。

7) 乙醚。

8) 水饱和酚。

9) 乙醇,

10) 皂土

11) 电动搅拌器。

12) 离心机,

13) 部分收集器。

14) 紫外分光光度计。


二 操作方法

1)250 g 新鲜面包酵母,加入 375 ml 蒸馏水,搅匀成糊状。

2) 再加入 500 ml90% 苯酚(改变细胞透性,使蛋白变性),电动搅拌 lh 后,放置于冰箱中过夜。

3)4000r/min 离心 15 min, 弃去上清液,下层为酚相,小心吸出后 (避免吸入蛋白质),每升加 20 g 乙酸钾和 2L 乙醇使 tRNA 沉淀,-20°C 过夜。

4)4000r/nin 离心 15 min。弃去上清液,沉淀用 95% 乙醇洗一次,4000r./min 离心15 min

5) 沉淀再用乙醚洗一次,4000r/min 离心 15 min

6) 沉淀溶于 25 ml0.1mol/LTEA 缓冲液中. 加入 0.025 g 皂土,1.5 g 氯化钠,0°C 静置 lh,4000r/min 离心 15 min。

7) 上清液用 0.1mol/I.TEA 缓冲液稀释 10 倍,上样到已用的含 0.lmol/LNaCl 的0.lmol/LTEA 缓冲液平衡的 DEAE 纤维素柱. 用含 0.2mol/LNaCl 的 TEA 洗涤,至流出液的 OD260<0.05 为止。

8) 用含 1mol/LMaCl 的 TEA 洗脱,分部分收集, 测定其 OD260,取其峰值部分的液体

9) 加 2 倍体积 95% 乙醇,一 20℃ 过夜(或 2 h)

10)4000r/min 离心 15 min。上清液弃去,沉淀以 67% 乙醇,95% 乙醇,无水乙醇及乙醚各洗一次。

11)4000r/mim 离心, 沉淀真空干燥,电泳检测 tRNA,


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