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RNA实验

哺乳动物细胞胞质RNA的分离

2024-06-20 RNA实验 加入收藏
材料与仪器冰冷的磷酸盐缓冲液 NaCl KCl Na2HP04•7H20 KH2PO4 冰冷的裂解缓冲液: LTris-HCl NaCl MgCL2 Nkmid


材料与仪器

冰冷的磷酸盐缓冲液 NaCl KCl Na2HP04•7H20 KH2PO4 冰冷的裂解缓冲液: LTris-HCl NaCl MgCL2 NkmidetP-40 胎盘 RNase 抑制剂 SDS 蛋白酶 K 酚 氯 仿 异戊醇 乙酸钠 (DEPC 处理) 无水乙醇 乙醇 乙酸钠 DEPC处理的水
Beckman JS 4. 2 转子或其他类似设备

步骤

一 材料与设备

1) 冰冷的磷酸盐缓冲液 (PBS):137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/l KCl,4.3 mmol/l Na2 HP04•7 H20,1.4 mmoI/L KH2PO4pH7.3

2) 冰冷的裂解缓冲液:50 mmol/LTris-HCl,pH 8.0 l00 mmoL/L NaCl,5 mmoL/L MgCL2), 0.5%(V/V)NkmidetP-40 1000 U/ml 胎盘,RNase 抑制剂 (如:RNasin) 及 1 mmol/LDTT,用 DEPC 处理的水配制,过滤除菌

3)20%SDS

4)20 mg/ml 蛋白酶 K

5) 酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)

6)3mol/L 乙酸钠 (DEPC 处理)pH 5.2

7) 无水乙醇

8)75% 乙醇/25%0.lmoL/L 乙酸钠,pH 5.2

9)DEPC 处理的水


二 操作方法

1) 收集细胞:①对于贴壁细胞,每 10 cm 的培养皿用 Iml 冰冷的 PBS 洗三次,再以小体积的 PBS 刮下细胞并转移到离心管中 (置于冰丄)300 g 离心 5 min 去上淸,冰上放置。

②对于悬浮细胞,以 300 g 离心 5 min 收集细胞,去上清。再用一半体积冰冷的 PBS重悬细胞,按前述方法离心并去上清。

2) 以 375ul 冰冷的裂解缓冲液重悬细胞,冰上孵 5 min。在_4℃ 用微型离心机离心2 min 上清转移至一装有 4ul20%SDS 的管中,立即振荡混匀。

3)加人 2.5ul20 mg/ml 的蛋白酶 K,37℃ 温育 5 min

4) 加人 400ul 酚:氯仿:异戊醇,振摇 Imin。离心,上层水相转移至一干净管中,重复抽提一次,再用 400ul 氯仿:异戊醇抽提一次. 上: 层水相转移至一干净管中。

5) 加人 40ul3mol/l 乙酸钠 (pH5.2) 和 lml 无水乙醇, 混合,冰上沉淀;15〜30 min 或一 20℃ 沉淀过夜。

6) 于 4℃ 以 1200 g 离心 15 min。再用 1 ml75% 乙醇/25½0.lmol/1 乙酸钠(PH5.2) 洗涤沉淀。干燥后溶于 100ulDEPC 水中。取出一小份测定其浓度及纯度,其余负 70℃ 保存

注意事项

1 ) 此方法一次可处理 2 X10个细胞,每 107 个细胞可获得 30〜100ug  RNA 。其 A260/080 应该在 1. 7〜2 . 0 之间。

2 ) 第二步操作重悬细胞时要小心操作,避免起泡沫,, 待悬液迅速变清,则显示细胞裂解完成

3 ) 如果所收集的细胞转染过 DNA,可用无 RNase 的 DNase  I  消化去掉污染的DNA , 再按前述的方法用酚:氯仿:异戊醇及氯仿:异戊醇抽提回收 RNA 。


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