几种果实总RNA提取方法的评价

广东农业科学 陈弟 多种RNA 提取方法的原理 Trizol法即异硫氰酸胍—苯酚法，异硫氰酸胍可以抑制RNA酶、防止RNA的降解，而酚的作用是使蛋白变性。其原理是内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸；由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分别位于中间相和水相，从而使DNA和RNA得到分离；取出水相后，通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。 热硼酸法 (Hot-borate，简称HB法)的原理是将硼酸缓冲体系、蛋白酶K消化蛋白和LiC1选择性沉淀RNA等步骤偶联在一起。硼酸可与酚类化合物依靠氢键形成复合物， 二硫苏糖 醇(DTT) 作为还原剂， NP-40 可阻止酚类物质氧化，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可与多酚化合物形成复合体，这些物质都可以抑制植物组织中酚类物质的氧化及其与RNA的结合，通过LiC1沉淀剩余的酚类物质，从而与RNA分开。 异硫氰酸胍法(Guanidine Thiocyanate，简称GT法)的提取液包括4 mol/L异硫氰酸胍、25 mmol/L柠檬酸钠( p H 7.0 )、0.5％十二烷基肌酸钠、0.1 mol/Lβ-巯基乙醇。其中，异硫氰酸胍作为强变性剂使核酸一蛋白结构发生变化，并有效解离核蛋白与核酸的复合体， 与β-巯基乙醇共同对RNase产生强烈的抑制作用，这样能破裂细胞并迅速释放核酸，然后通过CsCl梯度密度离心去除DNA，有效地得到总RNA。 十二烷基硫磺酸钠法(Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS法) 的提取液有 0.1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)、0.05 mol/L EDTA (pH8.0)、0.5 mol/L NaC1、1.5％SDS、0.01％β-巯基乙醇。 SDS 是一种离子去污剂，能从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖；EDTA以螯合二价金属离子，抑制RNA酶的活性，防止RNA降解；Tris-HCl不仅起缓冲作用，还可防止RNA降解；NaC1溶液可提供缓冲反应环境。在缓冲液中加入抗氧化剂或强还原剂(如β-巯基乙醇)，可以降低酶类(尤其是氧化酶类)的活性。通过苯酚和氯仿等有机溶剂的抽提去除蛋白质、多糖和酚类等杂质后，加入无水乙醇进行沉淀，即可使RNA分离出来。 十六烷基三甲基溴化铵法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide． 简称CTAB法)的抽提缓冲液包括2％ CTAB、100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1.4 mol/L NaC1、20 mmol/L EDTA (pH 8.0)。其中，CTAB作为离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使RNA得以游离出来；EDTA以螯合二价金属离子抑制RNA酶的活性，防止RNA降解；Tris-HCl不仅起缓冲作用，还可防止RNA降解；NaC1溶液提供缓冲反应环境。在缓冲液中加入抗氧化剂或强还原剂(如β-巯基乙醇) ，以降低酶类(尤其是氧化酶类) 的活性。而添加的苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性并使抽提液分相，由于RNA溶于水相，因此经离心后即可从抽提液中去除细胞碎片和大部分蛋白质；上清液中加入的无水乙醇可使 RNA沉淀，将沉淀出的RNA溶于TE溶液中即得RNA溶液；添加的还原剂(如β-巯基乙醇)和鳌合剂(如PVP) 可防止多酚氧化；低浓度乙醇或醋酸钾可去除多糖，从而达到高度纯化RN A的目的。