为什么细胞养不好？你可能忽略了这些细节
细胞传代培养
接下来我们就从细胞的衣食住行到传宗接代为大家逐一介绍，细胞培养时中常遇到的那些不可忽视的问题，及我们该如何解决呢？
一、细胞的营养来源
针对大多数肿瘤细胞，营养配方一般为：90%合成培养基（DMEM、RPMI1640、MEM等）和10%胎牛血清(FBS)；为了防止污染，可以加1%双抗！
常见问题解答：
Q：针对不同细胞，细胞培养基配方一样吗？如何获知呢？
A：不同细胞的培养基是不同的。一般ATCC购买的细胞，针对不同细胞株，会有详细介绍，包括生长的状态图、培养基的类型等。如人源乳腺癌细胞MCF-7细胞一般为1640，人源肺癌细胞A549可用DMEM培养基。
Q：培养基为什么一般都是偏红色？
A：因为培养基加了酚红来显示颜色，指示pH范围为6-8，颜色会由黄变为紫红。这是为了我们能更直观观察培养液的变化，如变黄，则代表偏酸，偏碱性了就显示偏紫色。一般来说，细胞吸收营养后，变黄后就暗示我们要换培养基啦！所以密切观察很重要哦！
Q：大多数细胞系可以在不止一种培养基中生长，那可以替换吗？
A：不建议更换ATCC指定的培养基，因为当培养基改变时，细胞的性质可能也会变化。
Q：若是细胞生长缓慢，是否可以增加血清比例？
A：可以！
二、细胞的居住环境
舒适无菌的环境是细胞健康生活的重要基础。如下图为培养细胞的器皿，包括形状、规格、用途多样的培养瓶、培养皿及培养板。最终住进37℃，5%CO2的恒温培养箱。
Corning细胞培养皿/板/瓶规格
常见问题解答：
Q：细胞培养板规格不一，如何正确选用？
A：根据不同规格的细胞培养皿/板容量及用途，如流式一般用 6 孔，爬片一般用 24 孔，MTT 一般用 96 孔，等。具体信息如下图所示。
（注：不同细胞大小形态不同，所获细胞量不同，上表中所获细胞量根据1*105个/cm2的密度计算而得。）
Q：细胞培养皿和培养瓶区别？
A：就细胞培养状态来说，培养瓶和培养皿没有太大区别，主要在于安全系数（培养瓶＞培养皿）、培养细胞数量（大培养瓶＞培养皿）。但是培养瓶成本也会相对较高，因此无特殊要求，一般选择培养皿即可。
三、细胞的复苏与冻存（原则是慢冻速融）
1. 细胞复苏：指将冻存的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。
复苏过程如下图所示：（操作步骤不再赘述）
常见问题解答：
Q：为什么细胞复苏后，很多难以贴壁？
A：忽略培养基的问题，主要考虑细胞冻存时状态差或者复苏时动作太慢导致细胞死亡。切记最重要的融化速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。
Q：为什么细胞贴壁了，却长不起来？
A：此时需要考虑的是细胞密度问题，一些细胞倾向于维持一定的密度，若复苏的细胞生长缓慢，可将细胞转移到较小的培养瓶/皿中培养。
2. 细胞冻存 将细胞放在低温环境（-70℃~-196℃），细胞内的代谢降低，可最大限度的保存细胞活力，以便长期储存。
常见问题解答：
Q：目前细胞冻存液多采用的什么配方？
A：目前细胞冻存多采用DMSO二甲基亚砜或甘油作保护剂，细胞冻存液的配方有很多种，如培养基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，复苏存活率在80%～90%以上。
Q：若没有细胞冻存盒，我们该怎么办？
A：可先将冻存管放入4℃冰箱中10min，再移至-20℃冰箱30min，-80℃冰箱2h或过夜，最后放入液氮罐内。为了节约时间，还可直接在冻存盒外包裹一团棉花，用棉花代替冻存盒缓慢降温的特点，将细胞转移至-80℃冰箱过夜，再转移至液氮保存。
Q：细胞冻存时对细胞量有要求吗？
A：细胞复苏时会有一定的细胞死亡，因此细胞的浓度应足够高，起始浓度106—107个/ml/管；
四、细胞的传代培养
细胞传代：细胞在培养过程中不断增殖，培养皿/瓶空间有限，当细胞接触过密，生长就会受到抑制，影响细胞状态，因此我们要把其中一部分细胞分到别的培养皿/瓶里。
如下图为操作的基本过程：
以上是贴壁细胞的操作方法，悬浮细胞传代很简单，不需消化，只需收集和分装。
如下图为贴壁和悬浮细胞的形态:
常见问题解答：
Q：为什么我们总说选择对数期细胞传代？
A：如下图：细胞的生长和分裂，一般遵循以下模式：停滞期，对数期（指数期），平稳期（平台期）和衰退期。为了确保活力，遗传稳定性和表型稳定，必须使细胞保持在对数期。
细胞在培养基中的生长曲线
Q：那如何确定细胞对数期？
A：根据上述细胞生长曲线，为了确保活力，必须使细胞保持在对数期就传代，所以一定不能等到细胞长满100%融合时才去消化传代。一般细胞长到 70% -80%左右即可传代。
Q：一般细胞传代都是1分2吗？
A：要根据不同细胞而定，如有的生长很快，比如说4T1细胞，传代取离心悬液的十分之一就已经足够了。有的又特别慢，比如 BT474。此时我们就要多观察摸索最合适的传代比例。
Q：消化很关键吗？
A：不得不说，细胞状态差，很多时候与传代时胰酶消化密切相关。一般肿瘤细胞消化1-2min即可。但是每一种细胞贴壁能力不同，因此对胰酶的反应也不同，我们需要密切跟踪。一般肉眼观察到贴壁细胞层能移动即可终止；而非细胞全部分散成单个。如下图分别是正确和错误的消化时间：
Q：部分比较难消化的细胞怎么办？
A：可放于37℃培养箱消化。以MDA-MB-231/PAX紫杉醇耐受细胞为例，放于37℃培养箱消化5-8min，轻轻拍打，才见细胞成片移动，因此针对难消化细胞一定要在显微镜下密切观察。
Q：几天换培养基？
A：正常情况下，培养液偏红色。如果细胞维持在pH6.5～6.6条件下，培养基变黄，说明培养液中代谢产物已堆积到一定量，细胞会脱落死亡，需要更换新鲜培养液。一般细胞生长旺盛时1～2天换一次，生长缓慢时，3～4天亦可。针对复苏后的细胞，建议隔天换液。
Q：每天观察细胞有必要吗？
A：一般的肿瘤细胞我们是隔天传代，但是切不可忽略对细胞的观察，一定要每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。记住，是每天。
Q：如果细胞形态不清晰或有异物等，如何处理？
A：可以考虑如下操作：首先，倒掉旧的培养基，用新的培养基或者PBS洗涤2-3次，再开始正式的消化、吹打。其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内。后续再密切观察。
Q：细胞污染怎么办？
A：如发现细胞有污染，一般应立即丢弃。如果细胞非常宝贵，可试着加入含抗生素的培养基反复清洗，并用抗生素含量高的培养基培养，并经常更换培养基；
本期的内容就介绍到这里了，细胞培养是后续实验的基石，看似简单的传代却有着大学问，希望大家在实践操作中，可以结合我们为大家提供的小细节，多多联系和摸索，相信你的细胞会养的更加漂亮！
参考文献：ATCC的动物细胞培养指南 ATCC®ANIMAL CELL CULTURE GUIDE tips and techniques for continuous cell lines
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