革兰氏染色法（细菌形态学检查实验）
一、简介细菌形态学检查在临床微生物学检验工作中更重要体现在标本直接制片染色显微镜下观察，对于感染性疾病病原体的诊断有重要的意义。 二、操作方法革兰氏染色法（细菌
一、简介
细菌形态学检查在临床微生物学检验工作中更重要体现在标本直接制片染色显微镜下观察，对于感染性疾病病原体的诊断有重要的意义。
二、操作方法
革兰氏染色法（细菌形态学检查实验）
三、原理
细菌经结晶紫初染染成蓝色。革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。
材料与仪器
金黄色葡萄球菌24h斜面培养物 大肠杆菌24h肉汤培养物
革兰氏染色液 生理盐水
载物玻片 接种环
步骤
一、方法
1. 按涂片→干燥→固定→染色→镜检的顺序进行。准备载物玻片：用镊子从载物片缸中取出经3％盐酸酒精脱脂的载物玻片，用擦片布擦净，然后用特种铅笔在玻片背面画一个直径为1.5~2.0cm的圆圈，做为涂膜的标记范围。
2. 点燃煤气灯：先把煤气灯的煤气孔和通气孔闭上，再把管道的煤气开关打开，然后把煤气灯的煤气口稍稍开放，立即用火柴点燃之，适当调节煤气孔和通气孔，使火焰长度在8~10cm，并能分清内外焰为止。
二、步骤
二、步骤
1. 涂片：按无菌操作取材法进行，具体步骤如下：
用肉汤培养物涂片：
（1）右手拿接种环的黑色塑料柄部分，左手托持试管。
（2）将接种环按15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌，直到把金属丝烧红(图1-2)，然后将铝制的银色柄部也通过火焰略加烧灼。
（3） 用右手小指和手掌的前内缘拔掉左手所持试管的棉塞，并立即将试管口用火焰烧灼灭菌。
（4） 用灭菌后已冷却的接种环伸入试管中取出材料(图1-3)，此时注意勿使沾有材料的接种环触碰试管壁及试管口。
（5） 将试管口再次灭菌，棉塞也要在火焰上略加烧灼（时间要短以免点燃棉塞），塞好棉塞，放回原处。
（6） 将接种环上之材料涂于载物片上，随后立即将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。
用斜面培养物涂片：
用细菌斜面培养物涂片，需预先取一接种环生理盐水放在载物片上，然后再按无菌操作取材法从斜面培养物上取少量菌苔，在水滴内轻轻研磨将细菌制成菌悬液，再涂成一薄膜。无菌操作取材步骤同前。
2. 干燥
放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。
放空气中自然干燥。如欲加速，也可把涂片置于火焰上部的热气层中烘烤，但切勿将涂膜烤焦。
3. 固定
用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标本固定于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。
用染色夹子夹住涂片，在火焰的最热部分连续通过三次，以固定之。此时杀死大部分细菌，并使标本固定于玻片上，以免在染色或水洗过程中被冲掉。
4. 染色
①将结晶紫染液加于涂膜上，染色（初染）1 min。
②水洗后加芦戈氏碘液处理(媒染)1 min。
③水洗后用95%酒精脱色，脱色时频频摇动玻片，直至流下的液体无色为止(约需0.5 min)。
④水洗后加石炭酸复红稀释液染色(复染)0.5 min。
⑤水洗，用滤纸轻轻吸干，待标本充分干燥后进行镜检。
染色过程中，水洗要用自来水的细流徐徐冲洗，冲洗涂膜的背面，勿使强水流直接冲到涂膜上。
三、结果观察
使用油镜观察，注意标本中两种细菌的形态、大小、排列各如何，最后判定染色性，哪种细菌是革兰氏阳性菌(染成紫色)，哪种细菌是革兰氏阴性菌(染成红色)。
将在标本中观察到的细菌形态和染色性，用有色铅笔画出模式图，并附以文字说明。
注意事项
1. 酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为好。
2. 被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在18~24h之内。
常见问题
一、革兰氏染色液的制备
1. 结晶紫染液
用天秤量取结晶紫5 g放乳钵内研碎，一面研磨一面徐徐加入95%酒精使之溶解。加入酒精全量为100 ml，制成酒精饱和液 (原液)。取原液20 ml，与1%草酸铵水溶液80 ml混合，用滤纸过滤。供革兰氏染色初染用。
2. 芦戈氏碘液
碘 1 g
碘化钾 2 g
蒸馏水 300 ml
配法是先用数毫升蒸馏水溶解碘化钾，然后加碘使其全溶解，最后加蒸馏水至300 ml。供革兰氏染色媒染用。
3. 稀释石碳酸复红染液
首先，取碱性复红10 g和95%酒精100 ml，按上述方法同①制成复红酒精饱合液。取复红饱和液10 ml，与5%石碳酸水溶液90 ml混合，用滤纸过滤，再用蒸馏水稀释10倍。供革兰氏染色复染用。
二、常见的与医学有关细菌的革兰氏染色性
