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微生物学

朊粒病的免疫学方法检测 PrPSc

2024-04-18 微生物学 加入收藏
简介肮粒(Prion,PrPS)又名脉病毒、肮毒体, 是一类由宿主细胞基因编码, 构象异常的蛋白,其不含核酸, 抵抗力强, 具有自我复制能力和传染性, 可引起多

简介

肮粒(Prion,PrPS)又名脉病毒、肮毒体, 是一类由宿主细胞基因编码, 构象异常的蛋白,其不含核酸, 抵抗力强, 具有自我复制能力和传染性, 可引起多种哺乳动物发生传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies,TSEs), 如羊瘙痒病、克雅病、库鲁病、疯牛病等。目前在人类及 20 余种动物中发现有 10 多种自然发生或感染的玩粒病。

原理

目前 Prr5 免疫学检测方法主要包括免疫组织化学法、免疫印迹和酶联免疫吸附等。

免疫组织化学法(IHC)方法的基本原理是组织切片上的抗原抗体反应。该方法能检出 PrP, 还能体现 PrP在脑中的组织分布特点。免疫印迹法(WB)是目前确诊肮粒病的常用方法。通过检测脑组织和脊髓匀浆中与广谱 PrP 单抗结合的 PrP 蛋白对蛋白酶K的抵抗力和分子量大小来判定诊断结果,并可实现对不同类型 (毒株)进行分型,酶联免疫吸附法(ELISA)主要用于脑组织和脑脊液中 Pr 的筛查。借助不同种属动物产生针对人 PrP 蛋白的特异性抗体, 检测患者标本中的 PrP。

材料与仪器

器材:组织切片、脑组织、脑脊液

步骤

朊粒病的免疫学方法检测 PrPSc 的实验步骤如下:

1. 免疫组织化学法(IHC)。该方法不仅能够检出 PrP~, 还能体现PrP在脑中的组织分布特点, 是目前确诊肮粒病最可靠的诊断方法。其原理为组织切片上的抗原抗体反应。IHC检测脑组织中 PrP 的基本步骤如下:

①醋酸处理→②甲醛固定→③包埋、切片→④高压蒸汽处理→⑤内源性过氧化物酶去除→⑥切片抗原抗体反应(一抗、二抗)→⑦显色→⑧淡染细胞核→⑨脱水封片, 镜检。

在样品固定阶段, 选择适当的固定时间、固定液浓度和体积以最大限度地保存组织细胞的抗原性; 在高压蒸汽处理阶段, 通过热效应来充分破坏 PrP 并暴露 PrP, 使抗原决定簇暴露。高压蒸汽处理对实验结果至关重要, 关键因素包括:①温度:> 100 ℃;②时间:3~15 分钟;③修复液 pH:7.5~8.5。

接下来, 再利用 PrP 单抗与组织中的 Pr 产结合。在显色阶段, 因样品不同, 抗原含量不等, 显色时间可有一定差异。最后,分别在低倍, 高倍镜下观察 Pr 蛋白沉积, 凡在灰质区出现成片的暗红色染色颗粒的判为阳性。

2. 免疫印迹法(WB)。WB是目前确诊肮粒病的常用方法。通过检测脑组织和脊髓匀浆中与广谱 PrP 单抗结合的 PrP 蛋白对蛋白酶K的抵抗力和分子量大小来判定诊断结果,并可实现对不同类型(毒株)进行分型, 是目前多家国际机构认可的 PrP 常规检测方法。该方法具有良好的灵敏度和特异性, 但受到如蛋白酶K的浓度和作用时间, 所用抗体种类等因素的影响, 其中样品采集和蛋白提取是确保实验结果的关键。这种方法不仅可以对 PrP~ 进行特异性检测, 还能测 Pr 在不同糖基化状态下的分子量, 结合基因序列分析, 对阮粒病进行基因分型。

3. 酶联免疫吸附法(ELISA)。 ELISA 主要用于脑组织和脑脊液中 PrP 的筛查。借助不同种属动物产生针对人 PrP 蛋白的特异性抗体, 检测患者标本中的 PrP。目前常用 ELISA 夹心法或 ELISA 化学发光法对脑组织悬液或脑脊液中存在的 PrP 进行检测。


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