肠道感染病毒的分离鉴定

病毒分离是分子检测技术发明之前，用于EV检测的基本实验技术。大多数EV病毒可在多种人源或灵长类动物来源细胞系上进行增殖。但由于每种细胞系对不同EV的敏感性不同，没有任何一种细胞系可以用于分离所有型别的EV。

一般通过增加使用具有不同分离谱的细胞系种类，来增加分离EV的敏感性。最为常用的细胞系有：人横纹肌肉瘤细胞系（rhabdomyosarcoma，RD）、人喉癌上皮细胞系（human laryngeal epidermoid carcinoma，Hep-2）、 非洲绿猴肾细胞系（Vero）等。

转基因表达人CD155的鼠源细胞系（L20B）可用于PV的筛选。某些型别的EV不易在细胞系上增殖（如柯萨奇病毒A组部分型别），可在乳鼠上进行分离和培养。

器材：
①一次性无菌手套
②标本采集管
③棉签拭子
④培养箱

试剂：
①材料：待采标本
②PBS缓冲液
③培养基

肠道感染病毒的分离鉴定基本步骤如下：

（一）分离培养

在敏感细胞系上，EV增殖后可导致细胞的裂解，出现典型的细胞病变效应。CPE大多可在接种后7天内出现，正常细胞形态发生改变：显微镜下细胞变圆、缩小、细胞核固缩、折光率增加、细胞变性。对于EV滴度较低的标本，或增殖速度较慢的EV型别，在接种后14天内也可出现明显的CPE。

由于大多数细胞系不能够连续维持14天，因进行EV分离时，一般需盲传两代，每代细胞维持7天。此外，一些型别的EV在某些细胞系上无明显CPE，这时需要借助分子生物学方法确定EV是否分离成功。

某些标本中含有的细胞毒性物质可在首次接种后24小时内引起细胞毒性反应，导致细胞坏死、脱落。而细胞毒性反应有时不易与CPE进行区分，这时需要将第一代培养物冻化后，进行再次接种。再次接种后，由于细胞毒性物质被稀释，可避免细胞毒性反应的出现。

（二）核酸检测

反转录-聚合酶链反应，尤其是实时荧光RT-PCR（Real-time RT-PCR，rRT-PCR）具有快速、灵敏、特异的特点，被广泛应用于EV的核酸检测。EV基因组在5＇UTR较为保守，以此作为检测靶基因的RT-PCR和rRT-PCR方法主要用于EV的定性检测。而以VP1编码区作为检测靶基因的RT-PCR和rRT-PCR方法则可用于EV的检测及型别鉴定。

由于不同型别间VP1编码区核苷酸序列差异较大，且该区变异较大，因此对所有EV型别的检测，则需针对不同分组EV甚至不同型别EV设计多对引物或探针。某些标本中含有的PCR反应抑制物，以及引物、探针与病毒基因的不匹配导致体外扩增失败，都会导致假阴性结果的出现。

从病变部位或无菌部位分离到EV或检测到EV核酸，即可确认EV为引起相应临床症状的病原体。由于EV存在较大比例的亚临床感染，感染后并不引起临床症状。因此，从咽拭子或粪便和肛拭子中检测到EV病毒或核酸后，还需结合流行病学数据和临床表现进行具体分析，以确定EV是为致病病原。

（三）型别鉴定

根据基因特征和生物学特征，所有人EV属于EV-A、EV-B、EV-C、EV-D共4个组。

结构蛋白（P1），尤其是VP1编码序列与血清型的关联具有高度一致性。基于VP1编码序列的EV型别鉴定方法，为当前国际公认的EV分型和鉴定的分子生物学依据，原则如下：

①全长VP1编码区核苷酸序列与原型株同源性＞75％（氨基酸序列同源性＞85％ ），且与其他血清型同源性＜70％ 表明与原型株为同一型别；②全长VP1编码区核苷酸序列与原型株同源性＜70％ 表明为不同或新的型别；③全长VP1编码区核苷酸序列与原型株同源性在70％ 和75％ 之间，则需要通过进一步分析其他特点进行定型。

（四）血清学检测

恢复期血清特异中和抗体的4倍或4倍以上升高可作为EV感染的血清学诊断依据。但某些EV感染病例的恢复期中和抗体升高水平＜4倍，甚至低于急性期。可能是由于恢复期血清标本采集较迟。
急性期血清中特异性IgM抗体检测，可用于病毒感染的血清学诊断。EV存在较大比例亚临床感染。因此，经血清学检测证实的EV急性感染，是否是引起相应临床表现的原因，还需结合流行病学数据和临床表现进行具体分析。

1．柯萨奇病毒：病毒分离、普通RT-PCR、荧光定量RT-PCR均是实验室常用的柯萨奇病毒的检测方法，中和试验因操作较为复杂多数实验室已不采用。

值得注意的是，柯萨奇病毒A组多数型别的毒株不能在培养的细胞中生长，但近年研究报道，A组的一些病毒可以在人横纹肌肉瘤细胞系细胞上生长，并产生可见的细胞病变效应如CA-V6、CV-A10、CVA-16等。某些不易在细胞系上增殖的CV-A组病毒（CV-A19等），则可在乳鼠上进行分离和培养。而CV-B组病毒则大多数可以在细胞上培养，人喉癌上皮细胞系可提高CV-B组病毒的分离敏感性。

2．EV-A71：比较容易通过细胞培养分离到。HFMD病例疱疹液中分离到病毒或检测到病毒核酸，脑炎、脑膜炎病例脑脊液中检测到病毒或病毒核酸，即可确认EV-A71为致病病原。值得注意的是，EV-A71引起的脑炎及脑干脑炎患者的脑脊液中很少检测到EV-A71病毒颗粒或核酸。

患者或无症状感染者的急性期咽拭子、粪便和肛拭子也是EV-A71病原学检测的适宜标本类型，一般用于确定导致人群疾病暴发或流行的病原。从单个患者咽拭子、粪便或肛拭子中检测到EV-A71，还需结合临床和流行病学数据以确定EV-A71是否为引起临床疾病的病原。

3．EV-D70：感染后较少从呼吸道和粪便标本中检测到EV-D70，患者急性期结膜拭子为病原学诊断的理想标本类型。EV-D70可在细胞上进行分离培养，但标本中病毒核酸的直接检测有助于提高检测阳性率。

4．EV-D68：在体外细胞中增殖较困难，且其最适培养温度为33 ℃，低于大多EV的最培养温度（36 ℃）。呼吸道标本中病毒核酸的直接检测有助于EV-D68的检出。