病毒 的分离和鉴定

不同的病毒分离时采用不同的分离方法，这主要取决于目的病毒的生物学特性。常用的病毒分离方法有细胞培养法、鸡胚接种法、动物接种法，而对细胞、鸡胚不敏感，又没有合适动物模型的病毒，可采用基因克隆的方法。

器材：
①一次性无菌手套
②标本采集管
③棉签拭子
④电子显微镜
⑤微孔板条
⑥酶标仪
⑦PCR仪

试剂：
①材料：待采标本
②PBS缓冲液
③琼脂

病毒分离和鉴定根据病毒种类不同，其基本步骤可分为如下几种：

（一）痘病毒

1．用12日龄鸡胚做致死试验来鉴别天花病毒的不同型别。将痘苗病毒鼻内接种给乳鼠可导致致死性肺炎，有些痘苗病毒株皮内注射可引起2日龄的家兔死亡，故可用乳鼠和乳兔鉴别不同毒株，也可以测定用于生产疫苗的痘种毒力。兔和小鼠是猴痘病毒的易感实验动物。

2．鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）法可用于正痘病毒的分离，副痘病毒和雅塔病毒不能用鸡胚绒毛尿囊膜法分离。

（1）分离天花和猴痘病毒时，将待分离标本（血液、唾液、涂片、水疱液、脓疱液和痂皮）制成悬液，接种于受精鸡胚（38～39 ℃孵育11～13天）绒毛尿囊膜上。

（2）将接种后的鸡胚置35 ℃，孵育72小时。

（3）在培养过程的观察中，记录鸡胚上脓疱出现的时间、形态、大小以及病灶颜色。此法可鉴别天花和猴痘病毒。天花病毒在CAM上形成直径为1 mm光滑圆盖状的痘斑，颜色呈灰白色或乳白色，无出血。放大10倍观察有一晕圈绕在不透明的中心周围，呈煎荷包蛋状；猴痘病毒在CAM上形成的痘斑直径1 mm左右，痘斑呈扁平而周围隆起，有些痘斑中心似火山口，有些痘斑出血，红细胞聚集在中心区。

3．细胞培养：多数人和灵长类动物细胞均可用于天花、猴痘等正痘病毒的培养。常规使用人胚肺、婴儿包皮二倍体细胞、原代恒河猴肾细胞、Vero细胞等。猴痘病毒、牛痘病毒和痘苗病毒接种细胞后，1～3天内感染细胞发生融合脱落，形成直径2～6 mm的空斑。天花病毒感染的细胞1～3天内形成多核融合细胞，并有细胞增生团，脱落空斑较小，直径1～3 mm。据此，猴痘病毒、牛痘病毒和痘苗病毒可与天花鉴别。另外，在单层细胞上，天花病毒产生细胞病变（CPE）而猴痘病毒不产生CPE。

（二）疱疹病毒

1．动物试验：将HSV接种家兔角膜，很容易引起家兔的角膜炎，并在家兔体内建立病毒的三叉神经节的潜伏感染，因此家兔是最常用的HSV角膜炎模型。另外也常用豚鼠作为HSV的生殖器感染模型。

2．细胞培养

（1）敏感细胞：多种动物细胞对疱疹病毒易感，可用于进行培养分离。原代兔肾、豚鼠胚成纤维细胞、人胚细胞（肾或肺）对单纯疱疹病毒最敏感，人肺二倍体MRC-5和WI-38细胞株对病毒也相当敏感，其他如传代细胞HeLa、Hep-2、A549，猴肾传代细胞如Vero、MA104等细胞也可用于病毒的分离培养，但敏感性不如人原代细胞和二倍体成纤维细胞。

人胚肺原代成纤维细胞、WI-38、MRC-5可用于VZV的分离培养；EB病毒的体外培养比较困难，一般用血清学方法进行辅助诊断，如需培养，应将咽漱液、唾液等标本直接接种到人脐带血淋巴细胞中，培养时间为4周；HCMV对宿主或组织培养细胞有明显的种属特异性要求，只有在同种的动物成纤维细胞中才能增殖，且培养分离方法是检测巨细胞病毒的金标准，所有一切新的检测技术均需要与此方法比较，才能获得正确的评价。

（2）细胞病变：HSV引起的细胞病变（CPE）的特点是，感染细胞肿大、变圆，折光性强，有的分离株会导致细胞融合，形成多核巨细胞，CPE出现快而明显。含有高浓度病毒的标本，可在接种后18～24小时出现CPE，病毒含量低的标本则需要4～5天才能观察到CPE。

如果在细胞培养液中添加地塞米松，可加快CPE的出现或者增加CPE病灶的数量。区别单纯疱疹病毒1型和2型的方法有4种：

①HSV-1不在鸡胚成纤维细胞形成空斑，而HSV-2常在此细胞形成空斑；②HSV-1对溴乙烯尿苷（BVDU）相当敏感，而HSV-2则对BVDU相对抵抗；③型特异性单克隆抗体分型；④DNA限制性内切酶图谱分析。

与HSV相比，VZV的复制周期长、繁殖缓慢，CPE通常在接种后3～14天才出现。病毒在感染细胞中的病灶开始局限，发展十分缓慢。病灶内的病变细胞肿胀变圆，出现核内嗜酸性包涵体，形成多核巨细胞。病毒可通过细胞与细胞间进行扩散而感染邻近细胞，细胞培养液中含有很少的感染性病毒。

HCMV在细胞培养中，CPE出现一般较慢，短者数天，长者可达数周，一般7～12天。特点是细胞膨胀，核变大，形成巨大的细胞，有折光性的细胞质颗粒和核内包涵体。病毒感染早期病毒与细胞紧密结合，病毒感染可在细胞之间传播，并逐步扩展至邻近细胞，病变细胞相互连接，形成感染灶。病灶中最先出现的病变细胞逐渐退化脱落，最后病变扩散到整个单层细胞。

（三）人乳头瘤病毒

有些情况下，病毒能够在细胞中发生流产感染。用跖疣的人乳头瘤病毒感染胎兔肾细胞或人胚肺成纤维细胞，可短暂刺激病毒DNA合成，但无细胞病变产生；在感染后的人成纤维细胞里可测出低水平的病毒DNA序列。