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细胞技术

涂片法(外周血细胞瑞氏(Wright)染色及计数实验)

2021-07-28 细胞技术 加入收藏
原理瑞氏染料中有美蓝和伊红两种成分,前者为碱性,后者为酸性,它们与细胞内的各种物质具有不同的亲和力,使其显现出不同的色调。血细胞核由去氧核糖核酸和强碱性的组蛋白、精蛋白等形成核蛋白。这种强碱性的物质与瑞氏染料中的酸性染料伊红有亲和力,所以染成红色;核蛋白中还有少量的 弱酸性蛋白,它们又与染液中的碱性染料美蓝起作用而染成蓝色,但含量太少,蓝色反应极弱 ,故核染色呈现紫红色。较幼稚的细胞之胞浆和细胞核

原理

瑞氏染料中有美蓝和伊红两种成分,前者为碱性,后者为酸性,它们与细胞内的各种物质具有不同的亲和力,使其显现出不同的色调。血细胞核由去氧核糖核酸和强碱性的组蛋白、精蛋白等形成核蛋白。这种强碱性的物质与瑞氏染料中的酸性染料伊红有亲和力,所以染成红色;核蛋白中还有少量的 弱酸性蛋白,它们又与染液中的碱性染料美蓝起作用而染成蓝色,但含量太少,蓝色反应极弱 ,故核染色呈现紫红色。较幼稚的细胞之胞浆和细胞核之核仁中含有酸性物质,它们与染料中的碱性染料美蓝有亲和力,故染成蓝色。

材料与仪器

血液
瑞氏染料 纯甲醇 磷酸二氢钾 磷酸氢二钠
显微镜 玻片 盖玻片 滴管

步骤

1. 制作血涂片


(1)滴一小滴血(约5 ul)于干净玻片上,推片与玻片应呈约30°角,用力均匀而较快,且不可复推。


(2)如血滴较小,推得较慢,角度小于30°,所制涂片较薄。


(3)如血滴较大,推得较快,角度比30°大时,则所制涂片较厚。


2. 将标本放平(最好置于一个固定架上),用滴管将染液滴于涂片上,可用滴管将染液驱散,使其布满整个涂片。


3. 染液布满整个涂片后,稍等片刻或立即加入缓冲液,并使缓冲液与染液混均匀。


4. 染液与缓冲液的比例


(1)染液量要充足,否则染液很快蒸发,将染料沉淀于细胞上。


(2)染液与缓冲液的比例为1:2~4左右比较合适。


(3)稀释度越大,染色时间越长,细胞着色较好,反之则越差。


5. 染色时间:视具体情况而定,一般约需10~30分钟。


6. 冲洗:用自来水冲洗涂片上之染料。


7. 显微镜检查:待自然干燥后用光学显微镜检查。

注意事项

1. 制作血涂片应避免气泡,厚度适中。


2. 染液与缓冲液的比例要适中。

常见问题

一、正常血细胞形态

1. 成熟红细胞:正常红细胞为两面微 凹而呈盘状,染色后则呈中心浅染之桔红色细胞,平均直径7.6 um。

2. 成熟中性粒细胞:PB中有两种,杆状核和分叶核。杆状核粒细胞形态:圆形或椭圆形,直径10~13 um。胞核如杆状、带状,胞核之凹超过假设核圆径的3/4,而且两端的内外有相当一段的平行。染色质凝固成块状,着色不均匀,其间可有空白区。胞浆内已不含有嗜碱性物质,而满布中性颗粒。中性分叶核粒细胞:圆形,直径10~13 um。核呈分叶状,少者分两叶,多者六、七叶以上,叶与叶之间有细丝相连或完全断开, 或互相重叠。染色质成细块状。胞浆内布满中性颗粒。

3. 成熟淋巴细胞:圆形,直径5~18 um。核圆形或拟蚕豆状,染色质致密成团块状。胞浆量少,蓝色,可有少许圆形、周边整齐的嗜天青颗粒。大淋巴细胞胞浆量多,呈淡蓝色

4. 单核细胞:圆形或不规则形,直径12~20 um。胞核居中或偏一侧,其形不规则。染色质凝集如筛底状或粗线条网状,但无凝集的块状染色质。胞浆量多,灰蓝色,散布许多细小的粉红色颗粒,颗粒多者甚至使胞浆成为粉红色,可有空泡和外浆出现。

5. 血小板:正常血小板为星形、逗点状或不规则状,直径2~5 um,呈淡蓝色,中央推聚 干淡紫红色的小颗粒。


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