Jurkat 细胞流式胞内染色

Jurkat 细胞系作为实验室常用的人类 T 细胞白血病细胞系，通常用于研究免疫生物学和癌症生物学相关的问题，而流式细胞术很适合检测 T 细胞的信号水平。本方法以 TCR 的刺激后检测 pERK 水平为例。

Jurkat 细胞受到刺激后会产生 TCR 信号，此时利用 4% PFA 固定细胞并用甲醇通透破膜，随后加一抗识别结合 TCR 蛋白，紧接着加相对应的荧光二抗，流式上机分选目的细胞。

检测激活的 Jurkat 细胞的 TCR 信号水平。

纯甲醇 -20 ℃ 预冷、RPMI 培养基

4 ℃ 预冷的 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS

细胞培养级 PBS

3×RPMI 配制的刺激物（TCR 抗体，PMA 等）

V 型底 96 孔板、荧光染料标记的二抗

Jurkat 细胞流式细胞术胞内染色的操作流程如下：

1、对培养的 Jurkat 细胞进行计数，每个样品取 2×105 的细胞于无血清的 RPMI 培养基 37 ℃ Rest 处理 1 h。

2、Jurkat 细胞每组实验，分为 0 min / 2 min / 5 min 的样，分别用 100 μl 的 PBS 重悬，转移到 96 孔板。

3、刺激物和细胞置于 37 ℃ 水浴锅或者金属浴 5 min 预热。

4、刺激+固定：加入 50 μl 的 3× 刺激物，37 ℃ 孵育固定时间点后快速加入 200 μl 4% PFA 终止刺激并固定细胞，轻微吹吸避免细胞聚团，37 ℃ 处理 15 min。

5、通透破膜：800 g 离心 3 min，去除上清，加冰甲醇重悬 100 μl→100 μl→100 μl，每加一次迅速吹打避免细胞聚团， 冰上 40 min。

6、800 g 离心 3 min，去除上甲醇后 100 μl 的 PBS 重悬细胞，漂洗三次细胞。

7、染一抗：100 μl PBS 重悬细胞后，加入 0.5 μl 兔源 pERK 一抗，室温孵育 1 h，200 μl PBS 漂洗一遍。

8、染二抗：100 μl PBS 重悬细胞后，加入 0.5 μl 的 anti-Rabbit-APC 二抗，室温避光孵育 1 h，200 μl PBS 漂洗两遍。

9、流式细胞分析仪上机检测，检测对应的荧光通道的信号。

a. pERK 的检测一定要用甲醇通透破膜，其他方法无法暴露 pERK 的抗原表位。

b. 每个孔加入的细胞量和抗体量要一致。

c. 关于胞内染色的方法以及抗体的选择，这个网站总结的最好 http://cytobank.org/facselect/

d. 通透处理后细胞会变小变透明，主要离心后细胞量的变化。

e. 样品少可以用低吸附 EP 管进行实验。

A. 通透后看不见细胞：细胞黏附在管壁上，使用低吸附管和 V 型底孔板。

B. 流式信号弱：选用合适浓度的未过期刺激物，或者适合做流式的一抗。

C. 操作时尽量温柔，避免过度破坏细胞结构。